香烟烟雾致BEAS-2B细胞恶变过程中表观遗传改变研究

【摘要】目的：对永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)进行体外香烟烟雾染毒,建立细胞体外染毒恶性转化模型,观察BEAS-2B细胞在恶性转化过程中相关抑癌基因的启动子甲基化情况和mRNA表达情况以及相关甲基化转移酶的表达情况,探究香烟烟雾致肺癌的发生机制,为筛选香烟烟雾致肺癌的早期分子标志物提供理论依据。方法：采用永生化的人支气管上皮细胞株(BEAS-2B细胞)进行体外染烟,在BEAS-2B细胞生长至对数生长期时,以5×104每皿的量接种于Transwell膜培养皿中培养,次日将Transwell膜培养皿置于细胞气体染毒装置进行香烟烟雾染毒,染毒装置的氧气浓度恒定在21%,水浴维持染毒腔温度为37-C,结合文献以及CCK–8结果确定合适的香烟烟雾染毒浓度以及染毒时间。细胞连续染毒两次作为染毒一代,共染毒30代,传代40代。分别检测对照组和染毒代1代、10代、20代、30代细胞及各自传代40代后其周期和凋亡率,ROS水平以及软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤实验等细胞恶性转化的指标。用Q-PCR技术检测各组细胞中甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况。用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测对照组细胞以及Sm20-40和Sm30-40中RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT以及重复序列LINE-1基因的甲基化状况并检测RASSF1A、p16和FHIT基因的表达水平。结果：(1)CCK.-8结果：CCK-8数据显示随着染烟浓度以及时间增加,细胞增殖抑制率也在不断上升,最终我们选择的染烟浓度为20%,染烟时间是10分钟,在此条件下,细胞染烟后增殖抑制率在30%左右。(2)基础指标检测：各染毒组细胞G1期比例均有所降低(P<0.05),S期细胞比例均有所上升(P<0.05)。细胞第一次染毒后凋亡率明显升高(P<0.05),但在染毒后期传代的细胞凋亡率明显降低,从Sm20-40到Sm30-40,与对照组相比具有统计学意义。各染毒组细胞与对照组相比,ROS水平均出现上升趋势,且随着染毒代数增加,出现剂量效应关系。(3)细胞恶性转化程度：细胞软琼脂克隆形成实验结果显示,BEAS-2B细胞在软琼脂中有较小的克隆形成率,在10%左右,但随着细胞染毒代数的增加以及传代,软琼脂克隆形成率逐渐增高,染毒30代克隆形成率最高,可达50%以上(P<0.05)。裸鼠成瘤实验表明染毒30代并传代40代的BEAS-2B细胞已具有体外裸鼠成瘤能力,Sm30-40细胞裸鼠成瘤率达到40%。分离瘤体做病理分析可见瘤细胞大小不一,呈弥漫性分布,异型性,为低分化癌,对照组裸鼠瘤体病理分析未见异型性明显的细胞。(4)基因表达以及甲基化状况：染毒并传代组细胞出现了DNMT1表达量下降的情况(P<0.05)；而相反的,染毒组细胞相对于对照组,DNMT3a表达量有不同程度的升高(P<0.05),到染毒后期最高,呈现出剂量效应关系。对RASSF1A、p16、RARβ、hMLH1、FHIT和LINE-1基因启动子特异位点的甲基化状况检测结果发现：对照组细胞RASSF1A、FHIT基因没有甲基化的表达,而染毒组细胞出现高甲基化状态：LINE-1在对照组细胞中出现高甲基化状态,而在染毒组细胞中呈现低甲基化状态。结论：1、确定了最佳染毒浓度以及时间,成功建立了体外染烟致BEAS-2B细胞恶性转化的模型。2、染毒后细胞出现了细胞增殖失控,具备了恶性特征且具有裸鼠成瘤性。3、抑癌基因RASSFIA和FHIT启动子区出现高甲基化状态,重复序列LINE-1则出现低甲基化状态,同时基因RASSF1A和FHIT的表达在染毒组发生了改变,这可能是香烟烟雾染毒导致细胞恶性转化的机制之一,也为筛选香烟烟雾致肺癌的早期分子标志物提供了一定的理论依据。
【作者】刘玉萍；
【导师】李建祥；
【作者基本信息】苏州大学，卫生毒理学，2014，硕士
【关键词】BEAS-2B细胞；香烟烟雾；抑癌基因；甲基化；

【参考文献】
[1]李文倩.纳米二氧化硅溶胶改性及其在水性聚氨酯乳液中的应用研究[D].上海大学,物理化学,2013,硕士.
[2]禹伟.车道变换与交通拥挤致因关系的研究[D].西南交通大学,交通工程,2013,硕士.
[3]刘刚,王亚飞,张恒,高凯晔,柯映林,段作衡.基于分屑原理的螺旋铣孔专用刀具研究[J].机械工程学报,2014,09:176-184.
[4]江华.基于光纤光栅传感的钻杆扭矩测量技术研究[D].合肥工业大学,光电信息工程,2014,硕士.
[5]唐艺.桥面加载铺装对桥梁结构的影响研究[D].重庆大学,土木工程,2014,硕士.
[6]韩琳琳.中国留学生在法国高校学习适应情况研究[D].广东外语外贸大学,法语语言文学,2013,硕士.
[7]牛钊峰.乌司他丁和奥曲肽对急性重症胰腺炎患者治疗作用的临床研究[D].山西医科大学,外科学,2013,硕士.
[8]李淑阔.淤泥层空间分布与水下淤积测定[D].山东大学,道路与铁道工程（专业学位）,2013,硕士.
[9]王俊强.基于Surfacelet的视频压缩感知算法研究[D].燕山大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[10]吴燕英.基于共价修饰的方法构建新型的多巴胺传感器[D].长春理工大学,2014.
[11]余绍山,袁乐平,贺正楚,张蜜,周永生.再生有色金属产业技术专利状况及发展对策研究[J].中国软科学,2015,03:41-54.
[12]郭新.改进遗传算法在电力系统无功优化中的研究[D].天津大学,电气工程,2013,硕士.
[13]石少帅.深长隧道充填型致灾构造渗透失稳突涌水机理与风险控制及工程应用[D].山东大学,岩土工程,2014,博士.
[14]钟海燕.向多核演变的中等带形城市交通体系规划研究[D].长安大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[15]张甜.新疆城镇化进程中农村剩余劳动力转移问题研究[D].新疆农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[16]陈中,杜文娟,王海风,唐国庆.电压稳定后紧急控制多代理系统框架[J].电力系统自动化,2006,12:33-37.
[17]谢玲莉.基于改进的2DPCA与神经网络的人脸识别研究[D].浙江理工大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[18]潘清.京师大学堂译学馆研究[D].华中师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[19]翟树芳.高校基层管理人力资源开发与管理若干问题研究[D].天津大学,2005.
[20]熊军.富氢气体中CO选择性甲烷化新型催化剂研究[D].华南理工大学,2012.
[21]王炜.海拉尔盆地凝析气井试气方法及配套工艺技术研究[D].浙江大学,构造地质学,2012,硕士.
[22]丁传羽.基于关键词的深度万维网查询[D].上海师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[23]宋婷.信用证软条款问题研究[D].安徽大学,国际商务,2013,硕士.
[24]齐宏亮.创建国家卫生城市对病媒生物防制效果影响研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,公共卫生,2013,硕士.
[25]邬志星.十八年来的苦与乐[J].新闻记者.1998(01)
[26]杨琳.GDC粉体的制备优化及其作为SOFC单电池阻挡层的应用研究[D].景德镇陶瓷学院,材料学,2014,硕士.
[27]刘琢扶.性激素及其受体在鼻咽纤维血管瘤发病机制中的作用[D].复旦大学,耳鼻喉头颈外科,2013,博士.
[28]张祎.Android软件静态分析系统的设计与实现[D].北京邮电大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[29]杜倩倩.球形区域内非线性椭圆型方程正解的存在性[D].东北大学,基础数学,2010,硕士.
[30]陈琪.边沁的功利主义政治哲学研究[D].南京航空航天大学,政治学理论,2013,硕士.
[31]张慈农.俄罗斯卫星系统通道的质量指标(续)[J].空间电子技术.1996(02)
[32]王玲玲.论非上市股份有限公司股权转让的章程限制[D].中国政法大学,民商法学,2014,硕士.
[33]刘亦文.基于无线传感器网络的远程路灯监控系统设计[D].北京交通大学,2014.
[34]徐静.质量驱动的数据仓库三层体系结构[D].中国海洋大学,2003.
[35]阙荣辉.硅碳纳米材料在纳米发电机中的应用研究[D].苏州大学,2012.
[36]祝晓钊.有机光电器件的界面调控与修饰[D].苏州大学,2013.
[37]陈义柱.髓系来源抑制细胞（MDSCs）在小鼠食管癌演进过程中的表达及调节的初步分析[D].苏州大学,免疫学,2013,硕士.
[38]曲珍.藏族传统文化对藏区公共治理的影响研究[D].华中科技大学,行政管理,2013,硕士.
[39]张玲,李庆军.花柱卷曲性异交机制及其进化生态学意义[J].植物生态学报,2002,04:385-390.
[40]林晓京.《日清英露四语合璧》的汉语语音词汇研究[D].厦门大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[41]马宝鹏.会话中言语不礼貌现象的语用研究[D].山东大学,英语语言文学,2013,硕士.
[42]张鹿.运动应激对氯胺酮成瘾相关行为的影响[D].中北大学,民族传统体育学,2014,硕士.
[43]吴慧群.澳门危机管理机制与对策研究[D].华中科技大学,行政管理,2013,硕士.
[44]赵佳佳.内极才情，外周物理[D].云南艺术学院,MFA,2013,硕士.
[45]卢晓慧,陈丽.论知识组织的方式和方法[J].情报杂志,2003,07:37-38.
[46]杨阳.含风力发电的电力系统故障诊断研究[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[47]尚恩明.双量子点系统中Majorana费米子和自旋输运的理论研究[D].南京大学,理论物理,2014,博士.
[48]王西文.高精度重力、地震综合预测油气藏(GONG)技术的应用实例[J].石油地球物理勘探,1997,03:387-398+462.
[49]王蕊.HaCaT细胞培养沙眼衣原体及体外药敏试验的探索[D].天津医科大学,皮肤病与性病学,2012,博士.
[50]李蕊.基于振荡器相位同步的认知网络动态频谱分配方法[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.